Qu’est-ce que la HPLC préparatoire ?
La HPLC préparatoire est une chromatographie liquide à haute performance (CLHP) qui permet de séparer et d’échantillonner des composants.
Elle peut améliorer la pureté des principaux composants par purification. Elle peut également être utilisée pour collecter des traces d’impuretés et d’autres composants dans un échantillon. Le principe de l’HPLC préparatoire est identique à celui de l’analyse HPLC normale. Donc, si une colonne appropriée est sélectionnée, il est possible de séparer et de purifier chaque composant en fonction de diverses caractéristiques du composé. Par exemple, la structure chimique, le poids moléculaire et la structure stérique.
De plus, en modifiant la taille de la colonne et la configuration de l’instrument, la HPLC préparatoire peut faire varier la quantité de produit cible obtenue de l’ordre du milligramme à celui du kilogramme.
Utilisations de la HPLC préparatoire
1. La purification des composants cibles après la synthèse chimique
La HLPC préparatoire se caractérise par sa capacité à utiliser le pouvoir de séparation élevé de cette dernière. Une fois que les pics ont été séparés sur la HLPC, ils peuvent être séparés et obtenus séparément.
Dans les domaines de la chimie organique et de la biochimie, les échantillons obtenus par synthèse chimique et biocatalytique contiennent de nombreux composants à l’état de traces (outre les composants principaux). Comme par exemple, des impuretés et des sous-produits. Il est donc difficile d’extraire sélectivement un seul composant en utilisant les méthodes de purification courantes telles que la purification sur colonne normale ou la recristallisation. La HPLC préparatoire, en revanche, est susceptible de pouvoir séparer les composants tant que la séparation par HPLC est envisageable.
2. L’analyse des réactions secondaires par séparation des composants principaux et des impuretés
Avec la HPLC préparatoire, chaque pic séparé par celle-ci peut être collecté comme une fraction distincte. Cela permet la collecte sélective des composants principaux et des impuretés à un niveau de pureté élevé. Les utilisations des échantillons de haute pureté comprennent, par exemple, l’évaluation des matériaux et des propriétés physiques dans l’industrie des matériaux. Ces derniers font usage de matériaux cibles de haute pureté obtenus par HPLC préparatoires.
Dans l’industrie chimique, l’analyse des réactions secondaires se produisant dans les systèmes de réaction est réalisée par l’analyse structurelle d’impuretés et de sous-produits de haute pureté.
3. La purification des protéines et des macromolécules
Dans le domaine des systèmes biologiques, la HPLC préparatoire est utilisée pour la purification des protéines à l’aide de colonnes de chromatographie d’exclusion de taille (SEC). Dans le domaine des macromolécules, on se sert également des colonnes SEC pour la purification des macromolécules et le fractionnement du poids moléculaire. Cela permet d’évaluer les propriétés physiques des composants individuels.
4. La purification des produits naturels
La capacité de séparation élevée de la HPLC est parfois utilisée pour extraire des substances cibles d’échantillons de produits naturels contenant une variété de composés. Des colonnes en phase inversée à haute capacité de séparation sont souvent utilisées.
Principe de la HPLC préparatoire
Le mécanisme de séparation de la HPLC préparatoire est similaire à celui de la HPLC analytique. Contrairement à d’autres méthodes de purification, telles que la purification sur colonne normale ou la recristallisation, la force de la HPLC préparatoire est qu’elle permet une purification. Cette purification est possible avec presque la même capacité de séparation que la HPLC analytique.
Les colonnes HPLC sont remplies de gel de silice poreux ou de gel de silice dont la surface est modifiée par des groupes fonctionnels tels que des groupes alkyles. Le matériau emballé est appelé phase stationnaire, le plus souvent du gel de silice modifié par des groupes octadécyles (ODS, C18). Lorsqu’une solution d’échantillon est injectée dans la colonne, les composants individuels de l’échantillon interagissent avec la phase stationnaire ou s’y répartissent.
La force de cette interaction, ou le degré de partage, dépend des propriétés physico-chimiques de chaque composant. Ainsi, chaque composant est séparé lors de son passage dans la colonne. Le principe de la HPLC est de séparer chaque composant de cette manière.
Autres informations sur la HPLC préparatoire
1. Fonctionnement des phases stationnaires (phase normale et phase inversée)
La fonction de la phase stationnaire dans une colonne dépend de la phase stationnaire. Par exemple, le gel de silice comme phase stationnaire et le solvant organique comme phase mobile constituent le principe de séparation connu sous le nom de “mode de phase normale”.
Le gel de silice est un support poreux qui adsorbe les substances à sa surface et la force de l’adsorption dépend de la substance. La séparation est ainsi réalisée lorsque l’échantillon passe à travers la colonne. Il adsorbe fortement les substances hydrophiles qui sont donc éluées plus lentement.
Lorsqu’une phase stationnaire modifiée par des alkyles est utilisée (comme dans les colonnes C18) et qu’un solvant organique hydraté est la phase mobile, le principe de séparation est connu sous le nom de “mode en phase inversée”. Le solvant organique hydraté correspond à l’eau et le C18 correspond à l’huile. La distribution est ensuite déterminée par l’affinité de la substance (hydrophile ou lipophile), la substance lipophile éluant plus tardivement. La raison étant qu’elle est répartie dans la phase stationnaire. Elles sont ainsi séparées selon qu’elles sont hydrophiles ou lipophiles.
2. HPLC préparatoire avec collecteur de fractions
La HPLC préparatoire peut être couplée à un dispositif appelé collecteur de fractions situé derrière l’instrument HPLC. Un collecteur de fractions est un dispositif qui sépare et recueille l’éluat HPLC sur une certaine période de temps.
Chaque éluat divisé par le collecteur de fraction peut être concentré pour obtenir un produit cible de grande pureté.
3. Système HPLC préparatoire de recyclage
Les systèmes HPLC préparatoires de recyclage sont équipés d’une vanne de commutation située derrière la colonne. Celle-ci permet aux éluats qui ont déjà traversé la colonne de repasser dans la même colonne.
En général, plus la colonne est longue, meilleure est la résolution HPLC. Par conséquent, en faisant passer l’éluant plusieurs fois dans la colonne, cela revient à avoir plusieurs colonnes connectées et allongées. Cela permet de séparer et de récupérer des composants qui n’auraient pas pu être séparés en un seul passage. Cependant, en raison de la configuration du dispositif avec la vanne de commutation, il est nécessaire de préparer un dispositif dédié séparé du dispositif HPLC normal.