Qu’est-ce qu’un microscope optique ?
Un microscope optique est un instrument permettant de grossir et d’observer de minuscules objets invisibles à l’œil nu à l’aide d’un oculaire et d’une lentille d’objectif.
Certains microscopes utilisent la fluorescence ou des lasers comme source de lumière mais ils utilisent généralement la lumière visible.
Le grossissement peut aller de quelques fois à 1500 fois. Il existe différents types de microscopes biologiques et métallurgiques en fonction de l’objet à observer. Ils sont utilisés en fonction de la transmissivité de la lumière de l’échantillon cible.
Les échantillons biologiques et métallurgiques qui transmettent la lumière sont observés en lumière transmise, tandis que les échantillons métalliques qui ne transmettent pas la lumière sont observés en lumière réfléchie. C’est pourquoi la source de lumière, l’objectif et la disposition de l’échantillon sont différents pour les microscopes biologiques et métallurgiques.
Utilisations des microscopes optiques
Les microscopes optiques sont largement utilisés dans divers domaines, tels que la biologie, la médecine, l’alimentation, les semi-conducteurs et l’éducation : ils utilisent la lumière visible comme source lumineuse et peuvent être observés directement par l’œil humain sans conversion de la lumière, ont une structure simple et sont relativement peu coûteux.
En particulier, ils sont utilisés dans divers tests tels que les tests sanguins, les tests microbiologiques, les tests de poussière et les tests de circuits intégrés, ainsi que dans des applications de recherche et de développement dans ces domaines.
Principe de la microscopie optique
Le principe d’un microscope optique est simple : la lumière est projetée sur l’objet à observer et la lumière transmise ou réfléchie à travers l’objet est grossie par la lentille de l’objectif.
L’observateur voit une image imaginaire de la lumière de l’objet grossie par la lentille d’objectif et encore grossie par l’oculaire. Le pouvoir grossissant du microscope optique est exprimé comme le produit du pouvoir grossissant de la lentille d’objectif et de la lentille d’oculaire multipliées ensemble. Plus le grossissement est important, plus un objet de petite taille peut être agrandi pour être observé.
Les microscopes peuvent être divisés en deux types selon la méthode d’éclairage : les microscopes à transmission et les microscopes à réflexion. Les microscopes à transmission sont utilisés pour les objets qui transmettent la lumière, tels que les cellules, les bactéries et autres échantillons biologiques, tandis que les microscopes à réflexion sont utilisés pour les objets qui ne transmettent pas la lumière, tels que les métaux et les semi-conducteurs. Ils sont également classés en fonction de la direction dans laquelle l’échantillon est observé, le type vertical ayant la lentille d’objectif positionnée au-dessus de l’échantillon et le type inversé ayant la lentille d’objectif positionnée au-dessous de l’échantillon. Le type inversé est notamment utilisé pour les échantillons cultivés dans une boîte de Petri car il est nécessaire d’observer l’échantillon par le bas. La figure montre une vue d’ensemble du microscope à transmission vertical le plus répandu.
Le grossissement d’un microscope optique est déterminé par le grossissement de l’objectif et de l’oculaire. Outre le grossissement, la résolution et le contraste sont également des facteurs importants en microscopie optique.
La résolution fait référence à la distance minimale (δ) à laquelle deux points différents peuvent être identifiés comme deux points et est un indicateur de la quantité de détails pouvant être identifiés. En microscopie, la résolution est déterminée par l’ouverture numérique de l’objectif (NA) et la longueur d’onde de la lumière (λ) et est exprimée par l’équation suivante.
δ = kλ/NA (k est une constante)
L’ouverture numérique NA est calculée comme n x sinθ, où n est l’indice de réfraction entre la lentille de l’objectif et le milieu et θ est l’angle maximal du rayon lumineux incident sur la lentille de l’objectif par rapport à l’axe optique.
Les échantillons biologiques, par exemple, sont souvent transparents, et si l’échantillon est observé tel quel, il peut être impossible de reconnaître la structure parce qu’elle est transparente. Dans ce cas, il est nécessaire d’ajuster les conditions d’observation en colorant l’échantillon avec un colorant ou en focalisant la lumière. La coloration et l’ajustement de la lumière ajoutent du contraste à l’image et facilitent l’observation de l’objet.
Ces dernières années, en plus de la coloration et de l’ajustement de l’ouverture, des méthodes d’observation utilisant la diffusion de la lumière, la diffraction et la fluorescence se sont imposées sous des noms tels que contraste de phase et interférence différentielle. Il existe également des microscopes optiques spécialisés dans ces méthodes d’observation, que l’on appelle microscopes à contraste de phase ou microscopes à interférence différentielle parmi les microscopes optiques. Lors de la coloration de cellules, par exemple, les cellules sont mortes, mais la microscopie à contraste de phase et la microscopie à interférence différentielle permettent d’observer des cellules vivantes.
Autres informations sur la microscopie optique
1. Différence entre l’observation en champ clair et en champ sombre en microscopie optique
Lors de l’observation au microscope optique, la manière dont la lumière est projetée sur l’objet modifie la façon dont celui-ci est vu. Il existe trois méthodes d’observation de base : l’observation en champ clair, l’observation en champ sombre et l’observation sous éclairage oblique.
La méthode d’observation en champ clair est la méthode d’observation la plus élémentaire. Elle consiste à éclairer l’objet avec de la lumière et à observer la lumière transmise. Elle est principalement utilisée pour observer des échantillons tachés.
La méthode d’observation en champ sombre, en revanche, consiste à éclairer l’objet par le dessous et à l’observer à l’aide de la lumière diffusée ou réfléchie. Cette méthode est principalement utilisée pour l’observation d’objets transparents non colorés et de petits objets.
La condition de base de l’observation en champ clair est de colorer l’objet, mais si l’objet est un organisme vivant, on craint que la coloration ne le tue ou n’endommage sa fonction, de sorte que la méthode du champ sombre est utilisée dans ce cas sans coloration.
L’observation avec un éclairage oblique est intermédiaire entre ces deux méthodes d’observation. En éclairant l’objet sous un angle oblique, il est possible d’obtenir une vue intermédiaire entre les méthodes d’observation en champ clair et en champ sombre.
2. Objectifs à immersion en microscopie optique
La résolution d’un microscope optique est inversement proportionnelle au nombre d’ouvertures, de sorte qu’une résolution plus faible peut être obtenue en augmentant le nombre d’ouvertures. Le nombre d’ouvertures est proportionnel à l’indice de réfraction entre l’objectif et le milieu. L’objectif à immersion utilise cette caractéristique pour obtenir une meilleure résolution en remplissant l’espace entre l’échantillon et l’objectif avec un liquide ayant un indice de réfraction élevé. Le liquide utilisé dépend de l’objet à observer.
Les objectifs qui utilisent de l’huile comme liquide sont appelés objectifs à immersion d’huile. L’huile a un indice de réfraction plus élevé que l’eau et a donc un meilleur effet de résolution. Toutefois, lors de l’observation d’un objet épais ou d’un espace entre l’échantillon et le verre de couverture, l’image formée par le microscope sera floue. Cela est dû à l’aberration sphérique causée par la lentille de l’objectif en raison de la différence d’indice de réfraction entre l’objet et le verre de couverture.
En revanche, un objectif qui utilise de l’eau comme liquide est appelé objectif à immersion dans l’eau. Les objectifs à immersion d’eau sont conçus pour produire la même image quelle que soit l’épaisseur de l’objet. Lors de l’observation d’objets fins, l’objectif à immersion dans l’huile fournit une image plus claire et plus lumineuse. A l’inverse, lors de l’observation d’objets plus épais, l’objectif à immersion dans l’eau offre de meilleures performances.