Qu’est-ce qu’un spectrofluorimètre ?
Un spectrofluorimètre est un instrument qui analyse la lumière émise par les molécules et les ions d’un échantillon.
Il s’agit d’un type de spectrophotomètre, les autres exemples étant les spectrophotomètres UV/visibles et les spectrophotomètres infrarouges. Comme le spectre d’émission diffère pour chaque molécule et chaque ion, il est possible de quantifier les composants contenus dans un échantillon sur la base de la longueur d’onde et de l’intensité des pics d’émission.
Les spectrofluorimètres sont extrêmement sensibles et détectent des constituants à l’état de traces. Ils sont également utilisés en biochimie pour analyser le mouvement des protéines in vivo en les associant à des sondes fluorescentes qui se lient à des composés spécifiques.
Dans les échantillons contenant de multiples composants, tels que les organismes vivants et les aliments, la luminescence de chaque composant se superpose, ce qui donne des spectres complexes. Récemment, des méthodes d’analyse statistique, telles que l’analyse multivariée, ont été appliquées pour extraire des informations sur de nombreux composants.
Utilisations de la spectrofluorimétrie
L’analyse quantitative par spectrofluorimétrie est généralement 1 000 fois plus sensible que la spectrophotométrie d’absorption. Aussi, les spectrofluorimètres sont utilisés pour détecter et quantifier de très petites quantités de composants dans un échantillon.
Parmi les exemples spécifiques, l’on peut citer la mesure du rendement quantique, un indicateur de l’efficacité lumineuse des LED blanches et des éléments EL organiques, ainsi que l’analyse spectrale de la lumière émise par les éléments. L’analyse spectrale est extrêmement complexe. Toutefois, les logiciels d’analyse sont de plus en plus sophistiqués et permettent d’extraire un large éventail d’informations.
Principe des spectrofluorimètres
Les spectrofluorimètres utilisent la fluorescence (ou la phosphorescence) : cette énergie supplémentaire est émise sous forme de lumière lorsque les électrons des molécules et des ions retournent de leur état excité à leur état fondamental. Chaque molécule possède son propre état énergétique et absorbe sélectivement la lumière d’une longueur d’onde spécifique pour passer à l’état excité.
Les électrons de l’état excité retournent immédiatement à l’état fondamental : ils y émettent de la lumière avec une longueur d’onde correspondant à la différence de niveaux d’énergie entre l’état excité et l’état fondamental. Si la longueur d’onde de la lumière irradiée n’est pas absorbée par l’échantillon, aucune fluorescence n’est émise et la mesure ne peut être effectuée.
Autres informations sur les spectrofluorimètres
1. Spectrofluorimètres et analyse multivariée
Les mesures de fluorescence sur des échantillons contenant un grand nombre de substances organiques, telles que les denrées alimentaires, ont été utilisées pour tenter d’effectuer des analyses permettant de classer les modèles en fonction de l’origine ou de la matière première. Lorsqu’un échantillon contient plusieurs composants, le spectre obtenu avec un spectrofluorimètre est la somme de la fluorescence émise par chaque composant.
En général, le spectre de fluorescence d’un échantillon contenant plusieurs composants est très complexe et difficile à analyser. Les échantillons contenant un grand nombre de substances organiques, comme les aliments et les boissons, produiront notamment de nombreux pics qui ne peuvent être analysés que par une personne qualifiée.
D’autre part, des tentatives ont été faites récemment pour obtenir des informations à partir de spectres d’émission complexes d’aliments et d’autres substances en utilisant des méthodes d’analyse multivariée et d’analyse statistique. Par exemple, l’analyse en composantes principales (ACP), l’une des méthodes d’analyse multivariée, permet de comprimer des données multidimensionnelles telles que des spectres en deux ou trois dimensions inférieures.
Après la compression 3D, la distribution de chaque échantillon peut être utilisée pour l’analyse de groupement.
2. Utilisation des spectrofluorimètres en biochimie
Dans le domaine de la biochimie, il est possible de quantifier les composants pertinents en liant sélectivement des sondes fluorescentes à des protéines spécifiques ou à des ions calcium. Par exemple, pour la détection des ions calcium, l’on peut utiliser des composés dont la structure piège sélectivement les ions, appelés agents chélateurs.
D’autres polymères modifiés à partir de protéines fluorescentes d’origine biologique servent aussi de sondes fluorescentes. Ces macromolécules sont dérivées de protéines fluorescentes et, une fois introduites, peuvent être reproduites par les cellules vivantes elles-mêmes.
C’est au scientifique japonais Osamu Shimomura, lauréat du prix Nobel, que l’on doit la découverte de cette protéine fluorescente verte. La possibilité d’introduire des protéines fluorescentes dans les biomolécules et de les détecter avec une grande sensibilité à l’aide d’un fluoromètre a considérablement fait progresser l’analyse des biomolécules.