¿Qué es la HPLC?
La HPLC (cromatografía líquida de alta resolución) es un método de separación y detección de compuestos individuales en una muestra mediante la interacción entre una columna y una muestra. Se puede medir fácilmente y puede detectar trazas de componentes, por lo que se utiliza en diversas industrias, principalmente farmacéutica, bioquímica, alimentaria y medioambiental.
Dado que el área del pico de HPLC es proporcional a la concentración de la muestra, también es posible cuantificar la concentración de los componentes contenidos en la misma. Dado que el comportamiento de separación de las muestras en HPLC difiere en función de la columna y la fase móvil, es necesario diseñar unas condiciones de análisis adecuadas.
Cómo utilizar los HPLC y sus Aplicaciones
La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es un método analítico que utiliza la interacción entre una columna y una muestra para separar cada componente de ésta. El método de uso es muy sencillo, y el análisis puede realizarse inyectando directamente la solución de muestra o colocando la solución de muestra en el automuestreador y realizando un procesamiento por lotes.
Los HPLC se utilizan en diversas industrias. Por ejemplo, se utilizan en el campo farmacéutico para analizar trazas de impurezas y principios activos, en los campos de la alimentación, las bebidas y el medio ambiente para analizar ingredientes nutricionales, ingredientes funcionales, aditivos y residuos de pesticidas, y en bioquímica para analizar proteínas y sustancias relacionadas con ácidos nucleicos.
Principios de los HPLC y las Columnas Utilizadas
Las HPLC y la cromatografía de gases (GC) son tipos de cromatografía. La cromatografía de compuestos es un método de separación que consiste en hacer pasar los componentes de un analito a través de una columna u otro medio, permitiendo que se adsorban a la columna, etc. El medio a través del cual fluyen los componentes de la muestra, como el disolvente en las HPLC o el gas en los GC, se denomina “fase móvil”, mientras que aquel al que se adsorbe la muestra, como una columna, se denomina “fase estacionaria”.
El tipo y la magnitud de la interacción entre los componentes de la muestra y la columna varían en función del tipo de columna. Por ejemplo, en una columna ODS, se modifica una cadena alquílica (grupo octadecil) en la columna, y la muestra se adsorbe por interacción hidrófoba.
Por otro lado, las columnas de gel de sílice tienen grupos silanol en la superficie que adsorben compuestos polares. También existen otros tipos de columnas, como las modificadas con grupos fenilo, grupos ciano y grupos amino.
Cálculo de la Concentración mediante el Área de Pico de las HPLC
El área de pico de las HPLC es proporcional a la concentración de una muestra. Sin embargo, cuando se utiliza un detector UV, el área del pico varía en función del coeficiente de absorbancia (facilidad de absorción de la luz) aunque la concentración de la muestra sea la misma. Por lo tanto, cuando se analizan concentraciones mediante HPLC, es necesario preparar estándares para comparar las áreas.
Un método para analizar concentraciones es el “método del estándar externo”. En este método, se preparan múltiples muestras estándar con concentraciones conocidas para el análisis por HPLC y se determinan las áreas de los picos. Dado que se conoce la concentración de cada muestra, se puede obtener una ecuación para determinar la concentración a partir del valor del área trazando el valor del área y la concentración.
El segundo método es el “método del patrón interno”. En este método, se añade otro compuesto que es química y físicamente estable como estándar interno a una muestra estándar con una concentración conocida. Tras la adición, se realiza un análisis por HPLC para determinar la relación entre el área del pico de la muestra patrón y la del patrón interno. Puede obtenerse una curva de calibración utilizando la relación de la cantidad del patrón interno añadido como abscisa y la relación de las áreas de pico como ordenada.
Detectores de HPLC y Límites de Detección
Existe una gran variedad de instrumentos disponibles como detectores de HPLC. Algunos ejemplos son los detectores ultravioleta-visible (UV-Vis), los detectores de fluorescencia y los detectores de índice de refracción diferencial (RID). Los límites de detección de estos detectores varían mucho en función de la muestra. Por ejemplo, el detector UV-Vis tiene un límite de detección de aproximadamente 10 picogramos (pg) y el detector de fluorescencia de 0.1 pg.
El más sensible es el espectrómetro de masas (EM), cuya sensibilidad de detección se estima en 0.01 pg. Sin embargo, el límite de detección depende del tipo y concentración de los compuestos en la muestra y del grado de separación. En algunos casos, la derivatización y la optimización del análisis de HPLCs, incluyendo el pretratamiento de la muestra, es necesaria para la detección de alta sensibilidad.