Was ist eine präparative HPLC?
Eine präparative HPLC ist eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), die die Trennung und Sammlung von Komponenten ermöglicht.
Sie kann die Reinheit verbessern, indem sie die Hauptbestandteile reinigt oder sie kann Spurenmengen von Bestandteilen wie Verunreinigungen in der Probe sammeln. Das Prinzip der präparativen HPLC ist identisch mit dem der normalen HPLC-Analyse, so dass es bei Auswahl einer geeigneten Säule möglich ist, jede Komponente nach verschiedenen Merkmalen der Verbindung wie chemische Struktur, Molekulargewicht und sterische Struktur, zu trennen und zu reinigen.
Darüber hinaus kann die präparative HPLC durch Änderung der Säulengröße und der Gerätekonfiguration die Menge des erhaltenen Zielprodukts von Milligramm bis Kilogramm variieren.
Anwendungen von präparativer HPLC
1. Aufreinigung von Zielkomponenten nach chemischer Synthese
Die präparative HPLC zeichnet sich dadurch aus, dass sie die hohe Trennleistung der HPLC ausnutzt: Sobald die Peaks auf der HPLC aufgetrennt wurden, können sie getrennt und separat gewonnen werden.
In der organischen Chemie und der Biochemie enthalten die aus chemischen und biokatalytischen Synthesen gewonnenen Proben neben den Hauptbestandteilen auch zahlreiche Spurenbestandteile wie Verunreinigungen und Nebenprodukte. Es ist schwierig, mit den üblichen Reinigungsmethoden wie der normalen Säulenreinigung oder der Umkristallisation selektiv nur eine Komponente zu extrahieren. Bei der präparativen HPLC hingegen ist es wahrscheinlich, dass die Komponenten getrennt werden können, solange eine HPLC-Trennung möglich ist.
2. Analyse von Nebenreaktionen durch Trennung von Hauptkomponenten und Verunreinigungen
Bei der präparativen HPLC kann jeder durch HPLC abgetrennte Peak als separate Fraktion gesammelt werden, was die selektive Sammlung von Hauptkomponenten und Verunreinigungen mit hoher Reinheit ermöglicht. Zu den Anwendungen für hochreine Proben gehören beispielsweise die Bewertung von Materialien und physikalischen Eigenschaften in der Materialindustrie unter Verwendung hochreiner Zielmaterialien, die mit präparativer HPLC gewonnen werden.
In der chemischen Industrie erfolgt die Analyse von Nebenreaktionen in Reaktionssystemen durch die Strukturanalyse von hochreinen Verunreinigungen und Nebenprodukten.
3. Aufreinigung von Proteinen und Makromolekülen
Im Bereich der biologischen Systeme wird die präparative HPLC zur Aufreinigung von Proteinen mit Hilfe von Größenausschlusschromatographie (SEC)-Säulen eingesetzt. Im Bereich der Makromoleküle werden SEC-Säulen auch zur Reinigung von Makromolekülen und zur Molekulargewichtsfraktionierung verwendet, um die physikalischen Eigenschaften der einzelnen Komponenten zu bewerten.
4. Aufreinigung von Naturstoffen
Die hohe Trennkapazität der HPLC wird manchmal zur Extraktion von Zielsubstanzen aus Naturstoffproben genutzt, die eine Vielzahl von Verbindungen enthalten. Häufig werden Umkehrphasensäulen mit hoher Trennkapazität verwendet.
Funktionsweise der präparativen HPLC
Der Trennmechanismus der präparativen HPLC ist dem der analytischen HPLC ähnlich. Im Gegensatz zu anderen Aufreinigungsmethoden wie z. B. der normalen Säulenreinigung oder der Umkristallisation liegt die Stärke der präparativen HPLC darin, dass sie eine Aufreinigung mit fast der gleichen Trennkapazität wie die analytische HPLC ermöglicht.
Die HPLC-Säule ist mit einem Material gepackt, das als stationäre Phase bezeichnet wird und an dessen Oberfläche funktionelle Gruppen wie Alkylgruppen und Hydroxylgruppen modifiziert sind. Das gepackte Material wird als stationäre Phase bezeichnet, in den meisten Fällen handelt es sich um Octadecyl- (ODS, C18) gruppenmodifiziertes Kieselgel. Wenn eine Probenlösung in die Säule eingespritzt wird, treten die einzelnen Komponenten der Probe mit der stationären Phase in Wechselwirkung oder verteilen sich in ihr.
Die Stärke dieser Wechselwirkung bzw. der Grad der Verteilung hängt von den physikalisch-chemischen Eigenschaften der einzelnen Bestandteile ab, so dass jeder Bestandteil beim Durchlaufen der Säule getrennt wird. Das Prinzip der HPLC besteht darin, jede Komponente auf diese Weise zu trennen.
Weitere Informationen zur präparativen HPLC
1. Funktion der stationären Phasen (normale und umgekehrte Phase)
Die Funktion der stationären Phase in einer Säule hängt von der stationären Phase ab. Ein Beispiel: Kieselgel als stationäre Phase und organisches Lösungsmittel als mobile Phase ist ein Trennungsprinzip, das als Normalphasenmodus bekannt ist.
Kieselgel ist ein poröser Träger, der Substanzen an seiner Oberfläche adsorbiert, wobei die Stärke der Adsorption von der Substanz abhängt, so dass eine Trennung erreicht wird, während die Probe die Säule durchläuft. Kieselgel adsorbiert stark hydrophile Substanzen, so dass hydrophile Substanzen langsamer eluieren.
Wenn eine alkylmodifizierte stationäre Phase verwendet wird, wie bei C18-Säulen, und ein wasserhaltiges organisches Lösungsmittel die mobile Phase ist, wird das Trennprinzip als Umkehrphasenmodus bezeichnet. Das wasserhaltige organische Lösungsmittel entspricht Wasser und C18 entspricht Öl, und die Verteilung richtet sich danach, welche Affinität die Substanz hat (hydrophil oder lipophil), wobei die lipophile Substanz später eluiert, weil sie in der stationären Phase verteilt ist. Auf diese Weise werden sie nach ihrer Hydrophilie oder Lipophilie getrennt.
2. Präparative HPLC mit Fraktionssammler
Die präparative HPLC kann mit einem so genannten Fraktionssammler hinter dem HPLC-Gerät gekoppelt werden. Ein Fraktionssammler ist ein Gerät, das das HPLC-Eluat über einen bestimmten Zeitraum trennt und sammelt.
Jedes Eluat, das durch den Fraktionssammler geteilt wird, kann konzentriert werden, um ein hochreines Zielprodukt zu erhalten.
3. Präparative HPLC-Recycling-Anlage
Präparative HPLC-Recycling-Anlagen sind mit einem Umschaltventil hinter der Säule ausgestattet, so dass Eluate, die die Säule einmal durchlaufen haben, erneut durch dieselbe Säule geleitet werden können.
Im Allgemeinen gilt: Je länger die Säule ist, desto besser ist die HPLC-Auflösung. Wenn der Eluent also mehrmals durch die Säule geleitet wird, ist das so, als wären mehrere Säulen miteinander verbunden und verlängert, was die Trennung und Rückgewinnung von Komponenten ermöglicht, die in einem einzigen Durchgang nicht getrennt werden konnten. Aufgrund der Konfiguration des Geräts mit dem Umschaltventil ist es jedoch erforderlich, ein spezielles, vom normalen HPLC-Gerät getrenntes Gerät vorzubereiten.