¿Qué es la HPLC Preparativa ?
La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) preparativa es una técnica que posibilita la separación y recuperación de componentes específicos.
Puede mejorar la pureza purificando los componentes principales, o puede recoger trazas de componentes como impurezas en la muestra. El principio de la HPLC preparativa es idéntico al del análisis por HPLC normal, de modo que si se selecciona una columna adecuada, es posible separar y purificar cada componente en función de diversas características del compuesto, como la estructura química, el peso molecular y la estructura estérica.
Además, cambiando el tamaño de la columna y la configuración del instrumento, la HPLC preparativa puede variar la cantidad del producto objetivo obtenido desde miligramos hasta el orden de kilogramos.
Usos de la HPLC Preparativa
1. Purificación de Componentes Diana tras Síntesis Química
La HPLC preparativa se caracteriza por su capacidad para utilizar el alto poder de separación de la HPLC: una vez que se obtienen picos separados en la HPLC, pueden separarse y obtenerse por separado.
En los campos de la química orgánica y la bioquímica, las muestras obtenidas a partir de síntesis químicas y biocatalíticas contienen un gran número de componentes traza, como impurezas y subproductos, además de los componentes principales. Es difícil extraer selectivamente un solo componente utilizando los métodos de purificación habituales, como la purificación en columna normal o la recristalización. En cambio, la HPLC preparativos permite separar los componentes siempre que sea posible la separación por HPLC.
2. Análisis de Reacciones Secundarias por Separación de Componentes Principales e Impurezas
Con la HPLC preparativa, cada pico separado por HPLC puede recogerse como una fracción independiente, lo que permite la recogida selectiva de componentes principales e impurezas de gran pureza. Las aplicaciones para muestras de alta pureza incluyen, por ejemplo, la evaluación de materiales y propiedades físicas en la industria de materiales utilizando materiales objetivo de alta pureza obtenidos por la HPLC preparativa.
En la industria química, el análisis de las reacciones secundarias que se producen en los sistemas de reacción se lleva a cabo mediante el análisis estructural de impurezas y subproductos de alta pureza. 3. Purificación de proteínas y proteínas.
3. Purificación de Proteínas y Macromoléculas
En el campo de los sistemas biológicos, la HPLC preparativa se utiliza para la purificación de proteínas mediante columnas de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). En el campo de las macromoléculas, las columnas SEC también se utilizan para la purificación de macromoléculas y el fraccionamiento del peso molecular para evaluar las propiedades físicas de los componentes individuales.
4. Purificación de Productos Naturales
La gran capacidad de separación de la HPLC se utiliza a veces para extraer sustancias diana de muestras de productos naturales que contienen una gran variedad de compuestos. A menudo se utilizan columnas de fase inversa con gran capacidad de separación.
Principio de la HPLC Preparativa
El mecanismo de separación de la HPLC preparativa es similar al de la HPLC analítica. A diferencia de otros métodos de purificación, como la purificación en columna normal o la recristalización, la ventaja de la HPLC preparativa es que permite la purificación con casi la misma capacidad de separación que la HPLC analítica.
Las columnas de HPLC se rellenan con gel de sílice poroso o gel de sílice con grupos funcionales, como grupos alquilo, modificados en la superficie. El material empaquetado se denomina fase estacionaria y suele ser gel de sílice modificado con grupos octadecilo (ODS, C18). Cuando se inyecta una solución de muestra en la columna, los componentes individuales de la muestra interactúan con la fase estacionaria o se dividen en ella.
La fuerza de esta interacción, o grado de partición, depende de las propiedades fisicoquímicas de cada componente, de modo que cada componente se separa al pasar por la columna. El principio de la HPLC consiste en separar cada componente de este modo.
Más Información sobre la HPLC Preparativa
1. Funcionamiento de las Fases Estacionarias (Normal y Reversa)
La función de la fase estacionaria en una columna depende de la fase estacionaria. Por ejemplo, el gel de sílice como fase estacionaria y el disolvente orgánico como fase móvil es el principio de separación conocido como modo de fase normal.
El gel de sílice es un soporte poroso que adsorbe sustancias en su superficie y la fuerza de la adsorción depende de la sustancia, de modo que la separación se consigue a medida que la muestra pasa por la columna. El gel de sílice adsorbe fuertemente las sustancias hidrófilas, por lo que éstas eluyen más lentamente.
Cuando se utiliza una fase estacionaria modificada con alquilo, como en las columnas C18, y un disolvente orgánico hidratado es la fase móvil, el principio de separación se conoce como modo de fase inversa. El disolvente orgánico hídrico corresponde al agua y el C18 al aceite, y la distribución viene determinada por la afinidad que tenga la sustancia (hidrófila o lipofílica), eluyendo más tarde la sustancia lipofílica por estar distribuida en la fase estacionaria. De este modo, se separan en función de si son hidrófilas o lipofílicas.
2. HPLC Preparativa con Colector de Fracciones
La HPLC preparativa puede acoplarse a un dispositivo denominado colector de fracciones situado detrás del instrumento de HPLC. Un colector de fracciones es un dispositivo que separa y recoge el eluido de la HPLC durante un cierto período de tiempo.
Cada eluido dividido por el colector de fracciones puede concentrarse para obtener un producto diana de alta pureza.
3. Sistema de la HPLC Preparativa de Reciclado
Los sistemas de la HPLC preparativa de reciclado están equipados con una válvula de conmutación detrás de la columna, que permite que los eluidos que han pasado una vez por la columna vuelvan a pasar por la misma columna.
Generalmente, cuanto más larga es la columna, mejor es la resolución HPLC. Por lo tanto, al pasar el eluyente varias veces por la columna, es lo mismo que tener varias columnas conectadas y alargadas, lo que permite la separación y recuperación de componentes que no podrían separarse en una sola pasada. Sin embargo, debido a la configuración del dispositivo con la válvula de conmutación, es necesario preparar un dispositivo dedicado separado del dispositivo normal de HPLC.