Was ist ein Mikroskope?
Ein Mikroskop ist ein Instrument zur Vergrößerung und Beobachtung kleinster Objekte, die für das bloße Auge unsichtbar sind, mit Hilfe eines Okulars und einer Objektivlinse.
Einige Mikroskope verwenden Fluoreszenz oder Laser als Lichtquelle, aber im Allgemeinen verwenden sie sichtbares Licht.
Die Vergrößerung kann von mehreren bis zu 1500-fach reichen. Es gibt verschiedene Arten von biologischen Mikroskopen und metallurgischen Mikroskopen, die je nach dem zu betrachtenden Objekt und der Lichtdurchlässigkeit der Zielprobe eingesetzt werden.
Biologische und metallurgische Proben, die Licht durchlassen, werden im Durchlicht betrachtet, während metallische Proben, die kein Licht durchlassen, im Auflicht betrachtet werden. Aus diesem Grund sind Lichtquelle, Objektiv und Probenanordnung bei biologischen und metallurgischen Mikroskopen unterschiedlich.
Verwendungszwecke von Mikroskopen
Lichtmikroskope sind in verschiedenen Bereichen weit verbreitet, z. B. in der Biologie, der Medizin, der Lebensmittelindustrie, der Halbleiterindustrie und im Bildungswesen, da sie sichtbares Licht als Lichtquelle verwenden und ohne Lichtumwandlung direkt vom menschlichen Auge beobachtet werden können, einfach aufgebaut und relativ kostengünstig sind.
Sie werden insbesondere bei verschiedenen Tests wie Bluttests, mikrobiologischen Tests, Staubtests und Tests von integrierten Schaltkreisen sowie bei Forschungs- und Entwicklungsanwendungen in diesen Bereichen eingesetzt.
Grundsätze der Mikroskopie
Das Prinzip der optischen Mikroskope ist einfach: Das zu beobachtende Objekt wird mit Licht bestrahlt, und das durch das Objekt durchgelassene oder reflektierte Licht wird durch die Objektivlinse vergrößert.
Der Beobachter sieht ein imaginäres Bild des durch das Objektiv vergrößerten Lichts (Bild) des Objekts, das durch das Okular weiter vergrößert wird. Die Vergrößerungsleistung des Mikroskops wird als das Produkt der Vergrößerungsleistung des Objektivs und des Okulars ausgedrückt, die miteinander multipliziert werden. Je höher die Vergrößerung ist, desto größer kann ein kleineres Objekt für die Betrachtung vergrößert werden.
Mikroskope lassen sich je nach Beleuchtungsart grob in zwei Typen einteilen: Durchlicht- und Auflichtmikroskope. Durchlichtmikroskope werden für Objekte verwendet, die Licht durchlassen, wie Zellen, Bakterien und andere biologische Proben, während Reflexionsmikroskope für Objekte verwendet werden, die kein Licht durchlassen, wie Metalle und Halbleiter. Sie werden auch nach der Richtung eingeteilt, in der die Probe betrachtet wird, wobei beim aufrechten Typ die Objektivlinse über der Probe und beim umgekehrten Typ die Objektivlinse unter der Probe angeordnet ist. Der umgekehrte Typ wird insbesondere für Proben verwendet, die in einer Petrischale kultiviert werden, da es notwendig ist, von unten in die Probe zu schauen. Die Abbildung zeigt eine Übersicht über die gängigsten aufrechten Transmissionsmikroskope.
Die optische Vergrößerung eines Mikroskops wird durch die Vergrößerung der Objektivlinse und des Okulars bestimmt. Neben der Vergrößerung sind auch die Auflösung und der Kontrast wichtige Faktoren in der Mikroskope.
Die Auflösung bezeichnet den Mindestabstand (δ), bei dem zwei verschiedene Punkte als zwei Punkte identifiziert werden können, und ist ein Indikator dafür, wie viele Details erkannt werden können. In der Mikroskopie wird die Auflösung durch die numerische Apertur des Objektivs (NA) und die Wellenlänge des Lichts (λ) bestimmt und durch die folgende Gleichung ausgedrückt.
δ = kλ/NA (k ist eine Konstante)
Die numerische Apertur NA wird berechnet als n x sinθ, wobei n der Brechungsindex zwischen der Objektivlinse und dem Medium und θ der maximale Winkel des auf die Objektivlinse einfallenden Lichtstrahls zur optischen Achse ist.
Als nächstes wird der Kontrast erklärt.
Biologische Proben zum Beispiel sind oft transparent, und wenn man die Probe so betrachtet, wie sie ist, kann es sein, dass man die Struktur nicht erkennen kann, weil sie transparent ist. In solchen Fällen müssen die Beobachtungsbedingungen durch Anfärben der Probe mit einem Farbstoff oder durch Fokussieren des Lichts angepasst werden. Färbung und Lichtanpassung erhöhen den Kontrast des Bildes und erleichtern die Beobachtung des Objekts.
In den letzten Jahren haben sich neben der Färbung und der Blendeneinstellung auch Beobachtungsmethoden mit Lichtstreuung, Beugung und Fluoreszenz etabliert, die unter Bezeichnungen wie Phasenkontrast und differentielle Interferenz bekannt sind. Es gibt auch auf diese Beobachtungsmethoden spezialisierte Lichtmikroskope, die unter den Lichtmikroskopen als Phasenkontrastmikroskope oder Differentialinterferenzmikroskope bezeichnet werden. Bei der Anfärbung von Zellen beispielsweise sind die Zellen tot, aber die Phasenkontrastmikroskopie und die Differenzialinterferenzmikroskopie ermöglichen die Beobachtung lebender Zellen.
Weitere Informationen zur Mikroskopie
1. Der Unterschied zwischen Hellfeld- und Dunkelfeldbeobachtung in der Mikroskopie
Bei der Beobachtung mit einem Mikroskop verändert die Art und Weise, wie das Licht auf das Objekt fällt, die Art und Weise, wie es gesehen wird. Es gibt drei grundlegende Beobachtungsmethoden: die Hellfeldbeobachtung, die Dunkelfeldbeobachtung und die Beobachtung unter schräger Beleuchtung.
Die Hellfeldbeobachtung ist die einfachste Beobachtungsmethode, bei der das Objekt mit Licht beleuchtet und das durchfallende Licht beobachtet wird. Sie wird hauptsächlich zur Beobachtung gefärbter Proben verwendet.
Bei der Dunkelfeldbeobachtung hingegen wird das Objekt direkt von unten beleuchtet und anhand des gestreuten oder reflektierten Lichts beobachtet. Diese Methode wird hauptsächlich für die Beobachtung von ungefärbten transparenten Objekten und kleinen Objekten verwendet.
Die Grundvoraussetzung für die Hellfeldbeobachtung ist die Anfärbung des Objekts. Handelt es sich bei dem Objekt jedoch um einen lebenden Organismus, besteht die Sorge, dass die Anfärbung ihn töten oder seine Funktion beeinträchtigen könnte, so dass in diesem Fall die Dunkelfeldmethode ohne Anfärbung angewendet wird.
Die Beobachtung mit schräger Beleuchtung liegt zwischen diesen beiden Beobachtungsmethoden. Indem man das Objekt aus einem schrägen Winkel beleuchtet, kann man eine Zwischenansicht zwischen der Hellfeld- und der Dunkelfeldbeobachtungsmethode erreichen.
2. Immersionsobjektive in der optischen Mikroskopie
Das Auflösungsvermögen eines optischen Mikroskops ist umgekehrt proportional zur Anzahl der Aperturen, so dass eine geringere Auflösung durch eine größere Anzahl von Aperturen erreicht werden kann. Die Anzahl der Öffnungen ist proportional zum Brechungsindex zwischen der Objektivlinse und dem Medium. Das Immersionsobjektiv macht sich diese Eigenschaft zunutze, um eine bessere Auflösung zu erzielen, indem der Raum zwischen der Probe und der Objektivlinse mit einer Flüssigkeit mit hohem Brechungsindex gefüllt wird. Welche Flüssigkeit verwendet wird, hängt von dem zu beobachtenden Objekt ab.
Objektivlinsen, die Öl als Flüssigkeit verwenden, werden als “Ölimmersionsobjektive” bezeichnet. Öl hat einen höheren Brechungsindex als Wasser und hat daher eine bessere Auflösungswirkung. Bei der Betrachtung eines dicken Objekts oder eines Spalts zwischen der Probe und dem Deckglas wird das vom Mikroskop erzeugte Bild jedoch aufgrund der sphärischen Aberration unscharf, die von der Objektivlinse durch den Unterschied im Brechungsindex zwischen dem Objekt und dem Deckglas verursacht wird.
Eine Objektivlinse, die Wasser als Flüssigkeit verwendet, wird dagegen als “Wasserimmersionsobjektiv” bezeichnet. Objektive mit Wasserimmersion sind so konzipiert, dass sie unabhängig von der Dicke des Objekts das gleiche Bild erzeugen. Bei der Beobachtung dünner Objekte liefert das Ölimmersionsobjektiv ein helleres und klareres Bild, bei der Beobachtung dickerer Objekte ist das Wasserimmersionsobjektiv besser geeignet.