¿Qué es un Microscopio Confocal?
Un microscopio confocal es un microscopio que dispone de un mecanismo para desenfocar la luz colocando un agujero de alfiler en el plano focal delante del detector, lo que permite adquirir imágenes nítidas y sin desenfoque.
Es un tipo de microscopio óptico que puede adquirir imágenes sin desenfoque a diferentes profundidades y reconstruirlas para obtener una imagen tridimensional y totalmente enfocada del objeto.
La microscopía confocal también se conoce como microscopios confocales, microscopía confocal láser (CLSM) o microscopía confocal de barrido láser.
Usos de los Microscopios Confocales
Los microscopios confocales se caracterizan por su alta sensibilidad y la alta resolución de las imágenes tridimensionales que producen, y se utilizan para la medición de la forma y el análisis de la forma de los objetos observados. Utiliza un láser para la medición sin contacto y es adecuado para medir objetos blandos o que no deben dañarse. Además, el pequeño diámetro de la punta del láser permite observar irregularidades diminutas.
Los microscopios confocales se utilizan con fines de inspección en el sector industrial y para observar células y organismos en campos de investigación como las ciencias de la vida.
1. Aplicaciones Industriales
Es posible medir la altura media dentro de un área de la imagen, la diferencia entre el área y un área de referencia, las alturas máxima y mínima, la planitud y la planeidad, etc. El procesamiento de imágenes produce una imagen tridimensional en color que permite al usuario observar intuitivamente las condiciones de la superficie y medir la rugosidad de la misma.
La imagen tridimensional resultante puede utilizarse para especificar cualquier área y medir su superficie y volumen, lo que permite cuantificar los arañazos y abolladuras en términos de volumen y el grado de aumento de la superficie para determinar las características del producto.
Las inspecciones para comprobar la diferencia entre productos buenos y defectuosos pueden mejorar la configuración general del trabajo. Se utiliza para inspeccionar placas de circuitos impresos y grandes paneles LCD.
2. Uso en las Ciencias de la Vida
En las ciencias de la vida, el sistema se utiliza para capturar y visualizar células y tejidos en tres dimensiones. Puede registrar cambios a lo largo del tiempo en tiempo real mientras las células y los órganos siguen vivos, y se utiliza para dilucidar y explorar sus funciones.
3. Aplicación a los Aparatos de Medición
Existen muchos instrumentos de medición que aplican los principios de la microscopios confocales, y se han desarrollado y comercializado diversos instrumentos, como los microscopios Raman, que se utilizan para la identificación de materiales, etc., y los microscopios de excitación multifotónica, más adecuados para observar zonas más profundas que los microscopios confocales.
Principio de los Microscopios Confocales
1. Estructura de los Microscopios Confocales
Los microscopios confocales constan principalmente de una fuente de luz, como un rayo láser, un divisor de haz, una lente, un estenopo y una unidad de detección.
La luz emitida por la fuente luminosa se guía a través de la lente de iluminación hasta el divisor de haz, se refleja e irradia sobre la muestra. La luz que regresa de la muestra se guía de nuevo a través de la lente del objetivo hasta el divisor de haces, donde se transmite. La luz es guiada a través de la lente de imagen y el agujero de alfiler hasta la unidad de detección.
2. Principio de los Microscopios Confocales
Los microscopios confocales producen una imagen escaneando un rayo láser enfocado puntualmente sobre la muestra y detectando la luz devuelta por la muestra.
En los microscopios confocales, sólo la luz en el punto focal pasa a través del agujero de alfiler y es detectada. La luz fuera del punto focal es cortada por el agujero de alfiler, lo que da como resultado una resolución en la dirección de la profundidad. Por otro lado, en la microscopía óptica, también se detecta la luz procedente del exterior del punto focal, especialmente en la dirección de la profundidad, y la luz procedente del exterior del punto focal se observa como un denominado desenfoque.
Por tanto, los microscopios confocales tienen una mayor resolución que la microscopía óptica convencional y proporcionan imágenes tomográficas ópticas que no pueden obtenerse con la microscopía óptica.
Tipos de Microscopios Confocales
Existen dos tipos principales de microscopios confocales: de barrido de punto único y de barrido multipunto.
En el tipo de barrido de punto único, el barrido se lleva a cabo mediante un escáner galvanométrico formado por dos espejos correspondientes a las direcciones X e Y, y el desenfoque se elimina mediante un agujero de alfiler colocado delante del detector, el tubo fotomultiplicador. El inconveniente es que tarda en producir una sola imagen, ya que se escanea en un solo punto. Para acelerar la exploración se pueden utilizar deflectores acústico-ópticos (AOD) y galvanómetros resonantes.
El escaneado multipunto utiliza un disco con muchos orificios dispuestos en espiral, y la luz se irradia mientras el disco gira a gran velocidad, de modo que el punto de escaneado se desplaza universalmente sobre la muestra y la escanea. La luz devuelta por la muestra es detectada por una cámara CCD o CMOS después de que otro disco con rotación sincronizada haya eliminado la borrosidad.
Por lo general, el barrido multipunto es más rápido que el barrido monopunto, y hay poca diferencia de tiempo dentro de una misma imagen, lo que lo hace adecuado para observar fenómenos que se producen a gran velocidad y cambios en el tiempo. También se han desarrollado tipos de exploración lineal, que utilizan rendijas en lugar de agujeros de alfiler para medir de forma lineal.