Qu’est-ce qu’un microscope à fluorescence ?
Les microscopes à fluorescence utilisent la lumière laser, les lampes à mercure à très haute pression ou les lampes au xénon comme source lumineuse pour observer la fluorescence des substances fluorescentes d’un objet. Dans les microscopes optiques ordinaires, la lumière visible, telle que les lampes halogènes, est utilisée comme source lumineuse pour irradier un objet et observer la lumière réfléchie ou transmise.
La microscopie à fluorescence est un type de microscopie qui se concentre principalement sur les tissus biologiques et les cellules marquées par des substances fluorescentes. La résolution d’un microscope dépend de la longueur d’onde de la lumière utilisée. Ceux à fluorescence utilisent une lumière de courte longueur d’onde. Ils se caractérisent donc par une excellente résolution spatiale et temporelle.
Il est ainsi possible d’obtenir des informations hautement quantitatives. La microscopie à fluorescence prend de plus en plus d’importance, car la microscopie confocale à laser et la multiphotonique sont de plus en plus sophistiquées.
Utilisations du microscope à fluorescence
Les microscopes à fluorescence sont principalement utilisés pour la bio-imagerie. Les cibles spécifiques sont les cellules et les tissus, qui peuvent être observés vivants. Les techniques suivantes sont utilisées en combinaison pour marquer des objets par fluorescence :
- Les techniques de marquage fluorescent de protéines spécifiques, par exemple par recombinaison génétique.
- Les techniques de marquage d’acides nucléiques et d’autres substances à l’aide de produits chimiques marqués par fluorescence.
- Les technologie permettant d’exprimer des protéines fluorescentes dans des cellules spécifiques.
Ces technologies permettent d’observer la localisation des protéines cibles et des gènes exprimés. De plus, des médicaments et des protéines qui émettent une fluorescence en réponse à des substances spécifiques ont été mis au point. Cela permet de visualiser l’activité neuronale et la dynamique des substances à l’intérieur des cellules.
Ces dernières années, l’avènement de la technologie CRISPR a grandement facilité la création d’organismes génétiquement modifiés. La gamme d’utilisations s’est donc élargie rapidement.
Principe du microscope à fluorescence
Un microscope à fluorescence est un appareil permettant d’observer la fluorescence. Cette dernière est émise lorsqu’une substance fluorescente absorbe une lumière spécifique sous forme d’énergie (lumière d’excitation) et la libère ensuite.
L’exposition à la lumière d’excitation provoque une émission rapide de lumière. La longueur d’onde de la fluorescence est supérieure à celle de la lumière d’excitation. Ces longueurs d’onde varient donc d’une substance fluorescente à l’autre. Afin d’observer une fluorescence spécifique, ce microscope dispose d’une unité de filtrage composée de :
- Un filtre qui transmet la lumière d’excitation provenant de la source lumineuse
- Un filtre qui transmet la fluorescence émise
- Un miroir pour empêcher l’interférence de la lumière d’excitation avec la fluorescence
En changeant ou en combinant les filtres, il est possible d’observer différentes substances fluorescentes à partir d’un même échantillon.
Autres informations sur le microscope à fluorescence
1. La résolution des microscopes à fluorescence
La résolution d’un microscope est définie comme “la plus petite distance à laquelle deux points proches peuvent être distingués de points différents”. Les microscopes utilisent des lentilles pour grossir et observer les objets. En principe, il est possible d’augmenter le grossissement à l’infini en combinant les lentilles.
Cependant, dans le cas des microscopes optiques, qui utilisent la lumière pour observer les échantillons, la limite de résolution est approximativement la moitié de la longueur d’onde de la lumière. Notamment en raison de la diffraction, qui est une caractéristique de la lumière. Cette limite était considérée comme la limite théorique de la résolution des microscopes, mais une nouvelle technologie a été mise au point pour dépasser cette limite. Cela a valu à ses concepteurs le prix Nobel de chimie en 2014.
Cette technique est connue sous le nom de “microscopie à super-résolution”. Avant le développement de celle-ci, la limite de résolution du microscope à fluorescence était d’environ 250nm. Cependant, depuis l’avènement de la microscopie à super-résolution, il est possible d’atteindre une haute résolution allant jusqu’à 15-100nm, ce qui est proche du microscope électronique. La microscopie à super-résolution utilise une variété de techniques pour contourner les facteurs limitant la résolution et atteindre une haute résolution.
Les méthodes de microscopie à super-résolution qui ont permis d’améliorer considérablement la résolution. Celles qui ont reçu le prix Nobel de chimie sont notamment “PALM” et “STED”. PALM et STED y sont parvenus en dépassant les limites de la résolution de la microscopie à fluorescence grâce à l’utilisation d’optiques et de colorants spéciaux. Des microscopes à super-résolution utilisant d’autres technologies ont été produits et sont commercialisés par diverses entreprises.
2. Les avantages de la microscopie à fluorescence
L’avantage de la microscopie à fluorescence est qu’elle permet d’observer en détail le comportement moléculaire et la structure cellulaire sous forme d’informations visuelles. En utilisant le microscopes à fluorescence approprié, l’objet peut être observé avec une haute résolution temporelle et spatiale.
Il est également possible d’observer des objets en utilisant plusieurs colorants. Par exemple, si deux protéines différentes sont marquées avec des substances fluorescentes rouge et verte, toute zone jaune indique que ces deux protéines peuvent être présentes au même endroit dans la cellule.
Diverses substances fluorescentes et divers microscopes à fluorescence ont été mis au point à des fins et pour des applications différentes. Ils prennent de plus en plus d’importance dans les sciences de la vie et la recherche clinique.