Was ist ein Fluoreszenzmikroskop?
Fluoreszenzmikroskope verwenden Laserlicht, Superhochdruck-Quecksilberlampen oder Xenonlampen als Lichtquelle, um die Fluoreszenz fluoreszierender Substanzen in einem Objekt zu beobachten. In gewöhnlichen Lichtmikroskopen wird sichtbares Licht wie Halogenlampen als Lichtquelle verwendet, um ein Objekt zu bestrahlen und das reflektierte oder durchgelassene Licht zu beobachten.
Die Fluoreszenzmikroskopie ist eine Art der Mikroskopie, die sich hauptsächlich auf biologische Gewebe und Zellen konzentriert, die mit fluoreszierenden Substanzen markiert sind. Die Auflösung eines Mikroskops hängt von der Wellenlänge des verwendeten Lichts ab. Fluoreszenzmikroskope, die Licht mit kurzen Wellenlängen verwenden, zeichnen sich daher durch eine hervorragende räumliche und zeitliche Auflösung aus.
Auf diese Weise lassen sich hochgradig quantitative Informationen gewinnen. Die Fluoreszenzmikroskope gewinnen immer mehr an Bedeutung, da die konfokale Lasermikroskopie und die Multiphotonenmikroskopie immer ausgereifter werden.
Anwendungen der Fluoreszenzmikroskope
Fluoreszenzmikroskope werden hauptsächlich für das Bio-Imaging eingesetzt. Die spezifischen Ziele sind Zellen und Gewebe, die lebend beobachtet werden können. Die folgenden Techniken werden in Kombination eingesetzt, um Objekte mit Fluoreszenz zu markieren:
- Techniken zur Fluoreszenzmarkierung bestimmter Proteine, z. B. durch genetische Rekombination.
- Techniken zur Markierung von Nukleinsäuren und anderen Substanzen mit fluoreszierend markierten Chemikalien.
- Technologien zur Expression fluoreszierender Proteine in bestimmten Zellen.
Mit diesen Technologien kann die Lokalisierung von Zielproteinen und exprimierten Genen beobachtet werden. Darüber hinaus wurden Medikamente und Proteine entwickelt, die als Reaktion auf bestimmte Stoffe Fluoreszenz ausstrahlen, wodurch die neuronale Aktivität und die Dynamik von Stoffen in Zellen sichtbar gemacht werden können.
In den letzten Jahren hat das Aufkommen der CRISPR-Technologie die Herstellung von genetisch veränderten Organismen erheblich erleichtert, und die Anwendungsmöglichkeiten werden immer vielfältiger.
Funktionsweise der Fluoreszenzmikroskope
Ein Fluoreszenzmikroskop ist ein Gerät zur Beobachtung von Fluoreszenz. Fluoreszenz entsteht, wenn eine fluoreszierende Substanz ein bestimmtes Licht als Energie absorbiert (Anregungslicht) und dann die Energie wieder abgibt.
Die Exposition mit Anregungslicht führt zu einer schnellen Emission von Licht. Die Wellenlänge der Fluoreszenz ist länger als die Wellenlänge des Anregungslichts, und diese Wellenlängen variieren zwischen den fluoreszierenden Substanzen. Um eine bestimmte Fluoreszenz beobachten zu können, verfügt das Fluoreszenzmikroskop über eine Filtereinheit, die aus folgenden Elementen besteht:
- einem Filter, der das Erregungslicht der Lichtquelle durchlässt
- einem Filter zur Übertragung der emittierten Fluoreszenz
- einem Spiegel, der die Interferenz des Anregungslichts mit der Fluoreszenz verhindert
Durch Auswechseln oder Kombinieren von Filtereinheiten lassen sich verschiedene fluoreszierende Substanzen in ein und derselben Probe beobachten.
Weitere Informationen zur Fluoreszenzmikroskopie
1. Auflösung von Fluoreszenzmikroskopen
Das Auflösungsvermögen eines Mikroskops ist definiert als der Mindestabstand, bei dem es möglich ist, zwei nahe beieinander liegende Punkte von verschiedenen Punkten zu unterscheiden. Mikroskope verwenden Linsen zur Vergrößerung und Beobachtung von Objekten, und im Prinzip ist es möglich, die Vergrößerung durch die Kombination von Linsen ins Unendliche zu steigern.
Bei Lichtmikroskopen, die zur Beobachtung von Proben Licht verwenden, liegt die Auflösungsgrenze jedoch aufgrund der Beugung, einer Eigenschaft des Lichts, bei etwa der halben Wellenlänge des Lichts. Dies galt als theoretische Grenze der Auflösung von Mikroskopen, aber es wurde eine Technologie entwickelt, die diese Grenze durchbricht, und die Entwickler wurden 2014 mit dem Nobelpreis für Chemie ausgezeichnet.
Die Technik ist als Superauflösungsmikroskopie bekannt. Vor der Entwicklung der Superauflösungsmikroskopie lag die Auflösungsgrenze der Fluoreszenzmikroskopie bei etwa 250 nm, aber mit der Superauflösungsmikroskopie kann eine hohe Auflösung von bis zu 15-100 nm erreicht werden, was der Elektronenmikroskopie nahekommt. Bei der Superauflösungsmikroskopie wird eine Vielzahl von Techniken eingesetzt, um die begrenzenden Faktoren der Auflösung zu umgehen und eine hohe Auflösung zu erreichen.
Zu den Methoden der Superauflösungsmikroskopie, die die Auflösung drastisch verbessert haben und mit dem Nobelpreis für Chemie ausgezeichnet wurden, gehören PALM und STED. PALM und STED haben dies erreicht, indem sie die Auflösungsgrenzen der Fluoreszenzmikroskope durch den Einsatz von Spezialoptiken und Spezialfarbstoffen durchbrochen haben. Superauflösungsmikroskope, die verschiedene andere Technologien verwenden, wurden bereits hergestellt und werden von verschiedenen Unternehmen vermarktet.
2. Vorteile der Fluoreszenzmikroskopie
Der Vorteil der Fluoreszenzmikroskopie besteht darin, dass sie eine detaillierte Beobachtung des molekularen Verhaltens und der Zellstruktur als visuelle Information ermöglicht. Durch die Verwendung eines geeigneten Fluoreszenzmikroskops kann das Objekt mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung beobachtet werden.
Es ist auch möglich, Objekte mit mehreren Farbstoffen zu beobachten. Werden beispielsweise zwei verschiedene Proteine mit roten und grünen Fluoreszenzstoffen markiert und beobachtet, so zeigen gelb gefärbte Bereiche an, dass diese beiden Proteine an der gleichen Stelle in der Zelle vorhanden sein könnten.
Eine Vielzahl von Fluoreszenzmaterialien und Fluoreszenzmikroskopen wurde für unterschiedliche Zwecke und Anwendungen entwickelt und gewinnt in der biowissenschaftlichen und klinischen Forschung zunehmend an Bedeutung.