¿Qué son los Microscopios?
Los microscopios son instrumentos para aumentar y observar objetos diminutos invisibles a simple vista mediante un ocular y una lente objetivo.
Algunos microscopios utilizan fluorescencia o láser como fuente de luz, pero en general emplean luz visible.
El aumento puede variar desde varias veces hasta 1.500 veces. Existen diferentes tipos de microscopios biológicos y microscopios metalúrgicos en función del objeto a observar, y se utilizan en función de la transmisividad de la luz de la muestra objetivo.
Las muestras biológicas y metalúrgicas que transmiten luz se observan mediante luz transmitida, mientras que las muestras metálicas que no la transmiten se observan mediante luz reflejada. Por este motivo, la fuente de luz, el objetivo y la disposición de la muestra son diferentes para los microscopios biológicos y metalúrgicos.
Usos de los Microscopios
Los microscopios se utilizan ampliamente en diversos campos, como la biología, la medicina, la alimentación, los semiconductores y la educación, porque utilizan luz visible como fuente luminosa y pueden ser observados directamente por el ojo humano sin conversión de la luz, tienen una estructura sencilla y son relativamente baratos.
Concretamente, se utilizan en diversas pruebas, como análisis de sangre, pruebas microbiológicas, pruebas de polvo y pruebas de circuitos integrados, así como en aplicaciones de investigación y desarrollo en estos campos.
Principios de los Microscopios
El principio de un microscopio es sencillo: se proyecta luz sobre el objeto que se desea observar y la luz transmitida o reflejada que atraviesa el objeto es aumentada por la lente objetivo.
El observador ve una imagen imaginaria de la luz (imagen) del objeto ampliada por la lente del objetivo y ampliada aún más por el ocular, y la potencia de aumento del microscopio se expresa como el producto de la potencia de aumento de la lente del objetivo y la lente del ocular multiplicadas entre sí. Cuanto mayor sea el aumento, más se podrá ampliar un objeto pequeño para su observación.
Los microscopios pueden dividirse a grandes rasgos en dos tipos según el método de iluminación: microscopios de transmisión y microscopios de reflexión. Los de transmisión se utilizan para objetos que transmiten la luz, como células, bacterias y otras muestras biológicas, mientras que los de reflexión se utilizan para objetos que no la transmiten, como metales y semiconductores. También se clasifican en función de la dirección en la que se observa la muestra: el tipo vertical tiene la lente del objetivo situada por encima de la muestra y el tipo invertido tiene la lente del objetivo situada por debajo de la muestra. En particular, el tipo invertido se utiliza para muestras cultivadas en una placa de Petri, ya que es necesario mirar la muestra desde abajo. La figura muestra una vista general del microscopio de transmisión vertical más popular.
El aumento óptico de los microscopios viene determinado por el aumento de la lente objetivo y del ocular. Además del aumento, la resolución y el contraste también son factores importantes en los microscopios.
La resolución se refiere a la distancia mínima (δ) a la que dos puntos diferentes pueden identificarse como dos puntos y es un indicador del grado de detalle que puede identificarse. En microscopía, la resolución viene determinada por la apertura numérica de la lente objetivo (NA) y la longitud de onda de la luz (λ) y se expresa mediante la siguiente ecuación
δ = kλ/NA (k es una constante)
La apertura numérica NA se calcula como n x sinθ, donde n es el índice de refracción entre la lente objetivo y el medio y θ es el ángulo máximo del rayo de luz que incide en la lente objetivo con respecto al eje óptico.
A continuación se explica el contraste.
Las muestras biológicas, por ejemplo, suelen ser transparentes, y si se observa la muestra tal cual, puede que no sea posible reconocer la estructura porque es transparente. En tales casos, es necesario ajustar las condiciones de observación tiñendo la muestra con un colorante o enfocando la luz. La tinción y el ajuste de la luz añaden contraste a la imagen y facilitan la observación del objeto.
En los últimos años, además de la tinción y el ajuste del diafragma, se han establecido métodos de observación que utilizan la dispersión de la luz, la difracción y la fluorescencia bajo nombres como contraste de fase e interferencia diferencial. También existen microscopios especializados en estos métodos de observación, que entre los microscopios se denominan microscopios de contraste de fase o microscopios de interferencia diferencial. Cuando se tiñen células, por ejemplo, éstas están muertas, pero la microscopía de contraste de fase y la microscopía de interferencia diferencial permiten observar células vivas.
Más Información sobre los Microscopios
1. Diferencia entre la Observación de Campo Claro y de Campo Oscuro en Microscopios
Al realizar observaciones con un microscopio, la forma en que la luz incide sobre el objeto cambia la forma en que se ve. Existen tres métodos básicos de observación: la observación en campo claro, la observación en campo oscuro y la observación bajo iluminación oblicua.
El método de observación de campo claro es el más básico y consiste en iluminar el objeto con luz y observar la luz transmitida. Se utiliza principalmente para observar muestras teñidas.
El método de observación de campo oscuro, por otro lado, ilumina el objeto directamente desde abajo y lo observa utilizando luz dispersa o reflejada. Este método se utiliza principalmente para observar objetos transparentes incoloros y objetos pequeños.
El requisito básico para la observación de campo claro es teñir el objeto, pero si el objeto es un organismo vivo, existe la preocupación de que la tinción pueda matarlo o dañar su función, por lo que en este caso se utiliza el método de campo oscuro sin tinción.
La observación con iluminación oblicua es intermedia entre estos dos métodos de observación. Al iluminar el objeto desde un ángulo oblicuo, es posible obtener una vista intermedia entre los métodos de observación de campo claro y de campo oscuro.
2. Objetivos de Inmersión en los Microscopios
La resolución de un microscopio es inversamente proporcional al número de aperturas, por lo que se puede conseguir una menor resolución aumentando el número de aperturas. El número de aberturas es proporcional al índice de refracción entre la lente del objetivo y el medio, y el objetivo de inmersión utiliza esta característica para obtener una mejor resolución rellenando el espacio entre la muestra y la lente del objetivo con un líquido de alto índice de refracción. El líquido utilizado depende del objeto a observar.
Los objetivos que utilizan aceite como líquido se denominan “objetivos de inmersión en aceite”. El aceite tiene un índice de refracción más alto que el agua y, por lo tanto, tiene un mejor efecto de resolución. Sin embargo, al observar un objeto con grosor o un espacio entre la muestra y el cubreobjetos, la imagen formada por el microscopio se verá borrosa debido a la aberración esférica causada por la lente objetivo a causa de la diferencia de índice de refracción entre el objeto y el cubreobjetos.
Por otro lado, una lente objetivo que utiliza agua como líquido se denomina “lente objetivo de inmersión en agua”. Las lentes objetivo de inmersión en agua están diseñadas para producir la misma imagen independientemente del grosor del objeto. Cuando se observan objetos finos, la lente de objetivo de inmersión en aceite proporciona una imagen más brillante y clara, pero cuando se observan objetos más gruesos, la lente de objetivo de inmersión en agua ofrece un mejor rendimiento.