¿Qué son los Microscopios de Fluorescencia?
Los microscopios de fluorescencia son herramientas utilizadas para observar la fluorescencia de sustancias fluorescentes en un objeto. Utilizan fuentes de luz como láseres, lámparas de mercurio de alta presión o lámparas de xenón para iluminar el objeto y detectar la luz emitida por las sustancias fluorescentes.
A diferencia de los microscopios ópticos convencionales, que utilizan luz visible para observar la luz reflejada o transmitida por un objeto, los microscopios de fluorescencia se centran en la observación de tejidos biológicos y células marcadas con sustancias fluorescentes.
La resolución de un microscopio está determinada por la longitud de onda de la luz utilizada. Los microscopios de fluorescencia que utilizan luz con longitudes de onda cortas se caracterizan por tener una excelente resolución espacial y temporal. Esto permite obtener información altamente cuantitativa y detallada.
Los avances en la tecnología de microscopía, como la microscopía láser confocal y la microscopía multifotónica, han mejorado aún más la capacidad de los microscopios de fluorescencia y los han vuelto cada vez más importantes en diversas áreas de investigación y aplicación científica.
Usos de los Microscopios de Fluorescencia
Los microscopios de fluorescencia se utilizan principalmente en investigaciones biológicas para obtener imágenes detalladas de células y tejidos vivos. Se emplean diversas técnicas para etiquetar objetos con fluorescencia, lo que permite la observación de proteínas específicas, ácidos nucleicos y otras sustancias.
Estas técnicas incluyen la recombinación genética para etiquetar proteínas específicas, el uso de productos químicos marcados con fluorescencia para etiquetar ácidos nucleicos y otras sustancias, y la expresión de proteínas fluorescentes en células específicas.
Estas tecnologías de etiquetado permiten visualizar la localización de proteínas diana y genes expresados. Además, se han desarrollado fármacos y proteínas que emiten fluorescencia en respuesta a sustancias específicas, lo que posibilita la visualización de la actividad neuronal y la dinámica de las sustancias dentro de las células.
En los últimos años, la tecnología CRISPR ha facilitado enormemente la creación de organismos modificados genéticamente, lo que ha ampliado rápidamente la gama de aplicaciones de los microscopios de fluorescencia en la investigación biológica.
Principio de los Microscopios de Fluorescencia
Un microscopio de fluorescencia es un dispositivo para observar la fluorescencia. La fluorescencia se emite cuando una sustancia fluorescente absorbe una luz específica como energía (luz de excitación) y luego libera de nuevo la energía.
La exposición a la luz de excitación provoca una rápida emisión de luz. La longitud de onda de la fluorescencia es mayor que la longitud de onda de la luz de excitación y estas longitudes de onda varían con la sustancia fluorescente. Para observar la fluorescencia específica, el microscopio de fluorescencia tiene una unidad de filtro que consta de:
- Un filtro que transmite la luz de excitación procedente de la fuente de luz
- Un filtro para transmitir la fluorescencia emitida
- Un espejo para evitar la interferencia de la luz de excitación con la fluorescencia.
Cambiando o combinando las unidades de filtrado, se pueden observar varias sustancias fluorescentes a partir de la misma muestra.
Más Información sobre Microscopios de Fluorescencia
1. Resolución de los Microscopios de Fluorescencia
La resolución de un microscopio se define como “la distancia más pequeña a la que es posible distinguir dos puntos cercanos de dos puntos diferentes”. Los microscopios utilizan lentes para ampliar y observar los objetos y, en principio, es posible aumentar infinitamente el aumento combinando lentes.
Sin embargo, en el caso de los microscopios ópticos, que utilizan luz para observar las muestras, el límite de resolución es aproximadamente la mitad de la longitud de onda de la luz debido a la difracción, que es una característica de la luz. Esto se consideraba el límite teórico de la resolución de los microscopios, pero se desarrolló una tecnología que superó este límite, y los desarrolladores fueron galardonados con el Premio Nobel de Química en 2014.
La técnica se conoce como “microscopía de superresolución”. Antes del desarrollo de la microscopía de superresolución, el límite de resolución de la microscopía de Fluorescencia se situaba en torno a los 250 nm, pero con la microscopía de superresolución se puede alcanzar una alta resolución de hasta 15-100 nm, cercana a la de la microscopía electrónica. La microscopía de superresolución utiliza diversas técnicas para eludir los factores limitantes de la resolución y lograr una alta resolución.
Entre los métodos de microscopía de superresolución que han mejorado drásticamente la resolución y han ganado el Premio Nobel de Química se encuentran “PALM” y “STED”. PALM y STED lo han conseguido superando los límites de resolución de los microscopios de fluorescencia mediante el uso de ópticas especiales y tintes especiales. Se han fabricado microscopios de superresolución que utilizan otras tecnologías y que están siendo comercializados por diversas empresas.
2. Ventajas de los Microscopios de Fluorescencia
La ventaja de los microscopios de fluorescencia es que permiten observar detalladamente el comportamiento molecular y la estructura celular como información visual. Utilizando los microscopios de fluorescencia adecuados para ello, el objeto puede observarse con una alta resolución temporal y espacial.
También es posible observar objetos utilizando múltiples colorantes. Por ejemplo, si se marcan dos proteínas diferentes con sustancias fluorescentes rojas y verdes y se observan, cualquier zona amarilla indica que estas dos proteínas pueden estar presentes en el mismo lugar de la célula.
Se ha desarrollado una gran variedad de materiales fluorescentes y microscopios de fluorescencia para diferentes propósitos y aplicaciones, y cada vez son más importantes en las ciencias de la vida y en la investigación clínica.