광학 현미경이란?
광학현미경(영어: Optical microscope)은 접안렌즈 및 대물렌즈로 육안으로 볼 수 없는 미세한 물체를 확대하여 관찰하기 위한 기기입니다.
광원으로 형광이나 레이저를 이용하는 것도 있지만, 일반적으로는 가시광선을 이용하는 것을 말합니다.
확대 배율은 몇 배에서 1500배 정도의 것이 있습니다. 관찰 대상의 차이에 따라 생물현미경과 금속현미경의 종류가 있으며, 대상 시료의 빛 투과성에 따라 구분하여 사용합니다.
빛을 투과하는 생물 시료 등은 투과광을 이용하고, 빛을 투과하지 않는 금속 시료 등은 반사광을 이용하여 관찰합니다. 따라서 생물현미경과 금속현미경은 광원과 렌즈, 시료의 배치가 다릅니다.
광학현미경의 사용 용도
광원으로 가시광선을 이용하기 때문에 빛을 변환하지 않고 사람의 눈으로 직접 관찰할 수 있어 구조가 간단하고 가격도 비교적 저렴하여 생물학, 의학, 식품 분야, 반도체 분야, 교육 분야 등 다양한 분야에서 널리 사용되고 있습니다.
구체적으로 혈액 검사, 미생물 검사, 분진 검사, 집적회로 검사 등 각종 검사에 사용하거나 해당 분야의 연구개발 용도 등입니다.
광학 현미경의 원리
그림 1. 광학 현미경의 원리
광학 현미경의 원리는 관찰 대상에 빛을 비추고, 대상물을 투과한 투과광 또는 반사광을 대물렌즈로 확대하는 단순한 원리입니다.
관찰자는 대상의 빛(상)이 대물렌즈로 확대되고, 그 빛(상)이 접안렌즈로 더욱 확대된 허상을 보게 되며, 광학현미경의 배율은 대물렌즈 및 접안렌즈의 확대 배율을 곱한 곱으로 표현됩니다. 배율이 높을수록 작은 물체를 크게 확대하여 관찰할 수 있습니다.
현미경은 조명을 비추는 방식에 따라 크게 ‘투과형’과 ‘반사형’ 두 가지로 나뉩니다. 투과형의 경우 세포나 박테리아 등 생물 시료와 같이 빛을 투과하는 물체에 사용되며, 반사형은 금속이나 반도체 등 빛을 투과하지 않는 물체에 사용됩니다. 또한 시료를 들여다보는 방향에 따라 분류하기도 하는데, 시료에 대해 대물렌즈를 위로 배치한 정립형과 아래로 배치한 역립형이 있습니다. 특히, 배양용 시료는 아래에서 들여다보아야 하기 때문에 거꾸로 된 타입이 많이 사용됩니다. 그림은 가장 많이 사용되는 정립형 투과형 현미경의 개요를 나타낸 것입니다.
광학 현미경의 광학 배율은 대물렌즈와 접안렌즈의 배율에 따라 결정됩니다. 또한, 광학 현미경으로 관찰할 때 확대 배율뿐만 아니라 해상도와 콘트라스트도 중요한 요소입니다.
분해능은 서로 다른 두 점을 두 점으로 식별할 수 있는 최소 거리(δ)를 말하며, 얼마나 세밀한 부분까지 식별할 수 있는지를 나타내는 지표입니다. 현미경의 경우 대물렌즈의 조리개 수(NA)와 빛의 파장(λ)에 따라 분해능이 결정되며, 다음 공식으로 표현됩니다.
δ = kλ/NA (k는 상수)
또한 조리개수 NA는 n×sinθ로 계산되며, n은 대물렌즈와 매질 사이의 굴절률, θ는 대물렌즈에 입사하는 광선의 광축에 대한 최대 각도입니다.
다음으로 콘트라스트에 대해 설명하겠습니다.
생체 시료 등은 투명한 경우가 많아 시료를 그대로 관찰해도 투명하게 비쳐서 구조를 인식하지 못하는 경우가 있습니다. 이런 경우 시료를 염료로 염색하거나 빛을 조절하여 관찰 조건을 조정해야 합니다. 염색이나 빛의 조정을 통해 상에 대비를 주어 대상물을 쉽게 관찰할 수 있도록 합니다.
최근에는 염색이나 조리개 조정 외에도 빛의 산란이나 회절, 형광을 이용한 관찰 방법이 위상차, 미분 간섭 등의 이름으로 확립되어 있습니다. 이러한 관찰 방법에 특화된 광학 현미경도 존재하며, 광학 현미경 중에서도 위상차 현미경이나 미분 간섭 현미경이라고 부릅니다. 세포 등을 염색하는 경우 세포가 죽게 되지만, 위상차 현미경이나 미분 간섭 현미경을 이용하면 살아있는 세포를 관찰할 수 있습니다.
광학 현미경의 기타 정보
1. 광학 현미경의 명시야 관찰과 암시야 관찰의 차이점
광학 현미경으로 관찰을 할 때, 대상에 빛을 비추는 방법에 따라 보이는 모습이 달라집니다. 기본적인 관찰 방법으로는 ‘명시야 관찰법’, ‘암시야 관찰법’, ‘편광조명 관찰법’의 세 가지가 있습니다.
명시야 관찰법은 가장 기본적인 관찰법으로, 대상에 빛을 비춰서 투과된 빛을 관찰하는 방법입니다. 주로 염색한 시료를 관찰할 때 사용합니다.
반면 암시야 관찰법은 빛을 바로 아래에서 비춰 산란광이나 반사광을 통해 관찰하는 방법입니다. 주로 착색되지 않은 투명한 대상이나 작은 대상의 관찰에 이용되는 방법입니다.
명시야 관찰법을 수행하기 위해서는 대상물을 염색하는 것이 기본이지만, 대상물이 생체라면 염색으로 인한 사멸이나 기능 손상이 우려되기 때문에 이 경우 염색하지 않고 암시야 관찰법을 이용하게 됩니다.
이 두 가지 관찰 방법의 중간이 편광 조명으로 관찰하는 방법입니다. 대상에 대해 비스듬히 빛을 비추면 명시야 관찰법과 암시야 관찰법의 중간 정도의 시야를 얻을 수 있습니다.
2. 광학 현미경의 침수 대물 렌즈
광학 현미경의 해상도는 조리개 수에 반비례하기 때문에 조리개 수를 늘리면 더 작은 해상도를 얻을 수 있습니다. 조리개 수는 대물렌즈와 매질 사이의 굴절률에 비례하는데, 침수 대물렌즈는 이 특성을 이용하여 시료와 대물렌즈 사이에 굴절률이 높은 액체를 채워서 더 나은 해상도를 얻는 방식입니다. 관찰하는 대상에 따라 사용하는 액체도 달라집니다.
오일을 액체로 이용하는 대물렌즈를 ‘오일 침지 대물렌즈’라고 합니다. 오일은 물보다 굴절률이 높기 때문에 해상도를 높이는 효과가 있어, 오일 침지 대물렌즈를 사용하면 밝고 선명한 상을 얻을 수 있습니다. 그러나 두께가 두껍거나 시료와 커버글라스 사이에 간격이 있는 대상을 관찰할 경우, 대상과 커버글라스의 굴절률 차이로 인해 대물렌즈에 의한 구면수차가 발생하여 현미경이 맺는 상이 흐려지게 됩니다.
한편, 물을 액체로 이용하는 대물렌즈를 ‘수침 대물렌즈’라고 합니다. 수침 대물렌즈는 피사체의 두께에 관계없이 동일한 상을 얻을 수 있도록 설계되어 있습니다. 얇은 피사체를 관찰할 때는 오일 침수 대물렌즈가 더 밝고 선명하게 볼 수 있지만, 두꺼운 피사체를 관찰할 때는 수침 대물렌즈를 사용하는 것이 더 좋은 성능을 얻을 수 있습니다.