Was ist ein Spektrofluorometer?
Ein Spektrofluorometer ist ein Instrument, das das von Molekülen und Ionen in einer Probe emittierte Licht analysiert.
Es ist eine Art von Spektralphotometer, andere Beispiele sind UV/sichtbare- und Infrarot-Spektralphotometer. Da das Emissionsspektrum für jedes Molekül und jedes Ion unterschiedlich ist, lassen sich die in einer Probe enthaltenen Komponenten anhand der Wellenlänge und der Intensität der Emissionsspitzen quantifizieren.
Spektrofluorometer sind äußerst empfindlich und werden zum Nachweis von Spurenbestandteilen eingesetzt. Sie werden auch in der Biochemie eingesetzt, um die Bewegung von Proteinen in vivo zu analysieren, indem sie mit fluoreszierenden Sonden kombiniert werden, die an spezifische Verbindungen binden.
In Proben, die mehrere Komponenten enthalten, wie z. B. lebende Organismen und Lebensmittel, überlagert sich die Lumineszenz der einzelnen Komponenten, was zu komplexen Spektren führt. In letzter Zeit werden jedoch statistische Analysemethoden, wie z. B. die multivariate Analyse, angewandt, um Informationen über viele Komponenten zu gewinnen.
Anwendungen der Spektrofluorometrie
Die quantitative Analyse mittels Spektrofluorometrie ist im Allgemeinen 1000-mal empfindlicher als die Absorptionsspektrophotometrie, sodass Spektrofluorometer zum Nachweis und zur Quantifizierung sehr geringer Mengen von Komponenten in einer Probe eingesetzt werden.
Konkrete Beispiele sind die Messung der Quantenausbeute, die ein Indikator für die Lichtausbeute von weißen LEDs und organischen EL-Elementen ist, und die Spektralanalyse des von den Elementen emittierten Lichts. Die Spektralanalyse ist äußerst komplex, aber die Analysesoftware wird immer ausgefeilter und kann eine Vielzahl von Informationen extrahieren.
Funktionsweise des Spektrofluorometers
Spektrofluorometer nutzen die Fluoreszenz (oder Phosphoreszenz), d. h. die zusätzliche Energie, die als Licht ausgestrahlt wird, wenn die Elektronen von Molekülen und Ionen aus ihrem angeregten Zustand in ihren Grundzustand zurückkehren. Jedes Molekül hat seinen eigenen spezifischen Energiezustand und absorbiert selektiv Licht einer bestimmten Wellenlänge, um in den angeregten Zustand überzugehen.
Die Elektronen im angeregten Zustand kehren sofort in den Grundzustand zurück und emittieren dann Licht mit einer Wellenlänge, die der Differenz der Energieniveaus zwischen dem angeregten und dem Grundzustand entspricht. Wenn das eingestrahlte Licht keine Wellenlänge hat, die von der Probe absorbiert wird, wird keine Fluoreszenz emittiert und die Messung kann nicht durchgeführt werden.
Weitere Informationen zu Spektrofluorometern
1. Spektrofluorometer und die multivariate Analyse
Bei Fluoreszenzmessungen an Proben, die eine Vielzahl organischer Stoffe enthalten, wie z. B. Lebensmittel, wurde versucht, die Muster je nach Herkunft und Rohstoffen zu analysieren und zu klassifizieren. Enthält eine Probe mehrere Komponenten, so ist das mit dem Spektrofluorometer ermittelte Spektrum die Summe der von jeder Komponente emittierten Fluoreszenz.
Im Allgemeinen ist das Fluoreszenzspektrum einer Probe, die mehrere Komponenten enthält, sehr komplex und schwer zu analysieren. Insbesondere bei Proben, die eine große Anzahl organischer Substanzen enthalten, wie z. B. Lebensmittel und Getränke, entstehen zahlreiche Peaks, die nur von einer erfahrenen Person analysiert werden können.
Andererseits wird neuerdings versucht, aus den komplexen Emissionsspektren von Lebensmitteln und anderen Stoffen mit Hilfe von multivariaten Analysen und statistischen Analyseverfahren Informationen zu gewinnen. So kann beispielsweise die Hauptkomponentenanalyse (PCA), eine der multivariaten Analysemethoden, verwendet werden, um mehrdimensionale Daten wie Spektren auf zwei oder drei niedrigere Dimensionen zu komprimieren.
Nach der 3D-Komprimierung kann die Verteilung der einzelnen Proben für eine Gruppierungsanalyse verwendet werden.
2. Spektrofluorometer in der Biochemie
In der Biochemie ist es möglich, die relevanten Komponenten durch selektive Bindung von Fluoreszenzsonden an bestimmte Proteine oder Kalziumionen zu quantifizieren. Für den Nachweis von Kalziumionen können beispielsweise Verbindungen mit einer Struktur, die Ionen selektiv einfängt, so genannte Chelatbildner, verwendet werden.
Andere Polymere, die aus fluoreszierenden Proteinen biologischen Ursprungs modifiziert wurden, werden ebenfalls als fluoreszierende Sonden verwendet. Diese Makromoleküle sind von fluoreszierenden Proteinen abgeleitet und können, wenn sie eingeführt werden, von der lebenden Zelle selbst repliziert werden.
Die Entdeckung dieses grün fluoreszierenden Proteins wird dem japanischen Nobelpreisträger Osamu Shimomura zugeschrieben. Die Möglichkeit, fluoreszierende Proteine in Biomoleküle einzubringen und sie mit hoher Empfindlichkeit mit einem Fluorometer nachzuweisen, hat die Analyse von Biomolekülen erheblich verbessert.