Was ist HPLC?
HPLC (High Performance Liquid Chromatography) ist eine Methode zur Trennung und zum Nachweis einzelner Verbindungen in einer Probe durch die Wechselwirkung zwischen einer Säule und einer Probe. Sie wird in einer Vielzahl von Branchen eingesetzt, vor allem in der Pharmazie, der Biochemie, der Lebensmittelindustrie und im Umweltbereich, da sie einfach zu handhaben ist und Spurenelemente nachweisen kann.
Da die Peakfläche der Hplc proportional zur Probenkonzentration ist, kann auch die Konzentration der Komponenten in der Probe quantifiziert werden. Das Trennverhalten von Proben in der Hplc hängt von der Säule und der mobilen Phase ab, so dass es notwendig ist, geeignete Analysebedingungen zu schaffen.
Verwendung der Hplc und ihre Anwendungen
Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) ist eine Analysemethode, die die Wechselwirkung zwischen einer Säule und einer Probe nutzt, um die einzelnen Bestandteile einer Probe zu trennen. Sie ist sehr einfach in der Anwendung und kann durch direkte Injektion der Probenlösung oder durch Einbringen der Probenlösung in einen Autosampler zur Stapelverarbeitung analysiert werden.
Die Hplc wird in einer Vielzahl von Branchen eingesetzt. So wird sie beispielsweise im pharmazeutischen Sektor zur Analyse von Spuren von Verunreinigungen und Wirkstoffen, im Lebensmittel-, Getränke- und Umweltsektor zur Analyse von Nähr- und Funktionsstoffen, Zusatzstoffen und Pestizidrückständen sowie in der Biochemie zur Analyse von Proteinen und nukleinsäureverwandten Substanzen eingesetzt.
Grundsätze der Hplc und verwendete Säulen
HPLC und Gaschromatographie (GC) sind Arten der Chromatographie. Die Chromatographie ist eine Methode zur Trennung der in einem Analyten enthaltenen Verbindungen, indem diese durch eine Säule oder ein anderes Medium geleitet und entsprechend der unterschiedlichen Adsorptionsstärke der einzelnen Komponenten getrennt werden.
Die Art und das Ausmaß der Wechselwirkung zwischen den Probenbestandteilen und der Säule hängen von der Art der Säule ab. Bei ODS-Säulen beispielsweise sind die Alkylketten (Octadecylgruppen) auf der Säule modifiziert und die Probe wird durch hydrophobe Wechselwirkungen adsorbiert.
Bei Kieselgelsäulen hingegen adsorbieren Silanolgruppen auf der Oberfläche polare Verbindungen. Es sind auch andere Arten von Säulen erhältlich, darunter mit Phenyl-, Cyano- und Aminogruppen modifizierte Säulen.
Berechnung der Konzentration anhand der Hplc-Peakflächen
Die Peakfläche der Hplc ist proportional zur Konzentration der Probe. Bei Verwendung eines UV-Detektors ändert sich die Peakfläche jedoch in Abhängigkeit vom Absorptionskoeffizienten (Lichtabsorptionsgrad), auch wenn die Konzentration der Probe gleich ist. Bei der Konzentrationsanalyse mittels Hplc ist es daher notwendig, Standards herzustellen, um die Flächen zu vergleichen.
Eine Methode zur Analyse von Konzentrationen ist die “externe Standardmethode”. Bei dieser Methode werden mehrere Standardproben mit bekannten Konzentrationen hergestellt und mittels Hplc analysiert, um die Peakflächen zu bestimmen. Da die Konzentration jeder Probe bekannt ist, kann durch Auftragen des Flächenwerts und der Konzentration eine Gleichung zur Bestimmung der Konzentration aus dem Flächenwert aufgestellt werden.
Die zweite Methode ist die “interne Standardmethode”. Bei dieser Methode wird eine andere chemisch und physikalisch stabile Verbindung als interner Standard zu einer Standardprobe mit bekannter Konzentration hinzugefügt. Nach der Zugabe wird eine Hplc-Analyse durchgeführt, um das Verhältnis der Peakfläche der Standardprobe zu der des internen Standards zu bestimmen. Unter Verwendung des Verhältnisses der zugesetzten Menge des internen Standards als Abszisse und des Verhältnisses der Peakflächen als Ordinate lässt sich eine Kalibrierkurve erstellen.
Hplc-Detektoren und Nachweisgrenzen
Als Hplc-Detektoren stehen eine Reihe von Instrumenten zur Verfügung. Beispiele sind UV-Vis-Detektoren, Fluoreszenzdetektoren und Differential-Brechungsindex-Detektoren (RID). Die Nachweisgrenzen dieser Detektoren sind je nach Probe sehr unterschiedlich. Beispielsweise liegt die Nachweisgrenze für UV-Vis-Detektoren bei etwa 10 Pikogramm (pg) und für Fluoreszenzdetektoren bei 0,1 pg.
Am empfindlichsten ist das Massenspektrometer (MS), das eine geschätzte Nachweisempfindlichkeit von 0,01 pg hat. Die Nachweisgrenze hängt jedoch von der Art und Konzentration der Verbindungen in der Probe und dem Grad der Trennung ab. In einigen Fällen ist eine Derivatisierung, d. h. die Anlagerung einer funktionellen Gruppe an die Probe, die Fluoreszenz erzeugt, erforderlich. Für einen hochempfindlichen Nachweis ist eine Optimierung der Hplc-Analyse, einschließlich der Probenvorbereitung, erforderlich.